Um estudo transversal observacional foi feito de fevereiro de 2008 a junho de 2010 em três hospitais terciários de Medellín, segunda cidade da Colômbia. Os pacientes até 14 anos infectados por S. aureus (MSSA‐MRSA) foram recrutados prospectivamente e apenas o primeiro isolado de cada indivíduo foi avaliado. Todos os pacientes isolados com MRSA obtidos durante o período do estudo foram incluídos e, considerando que a prevalência de MSSA é maior, uma amostra foi definida. O tamanho da amostra foi calculado com base na prevalência de MSSA em 2007 em cada instituição, totalizou 65 isolados. Os isolados com MSSA incluídos foram selecionados aleatoriamente todo mês, de fevereiro de 2008 a junho de 2010, com uma tabela de números aleatórios de acordo com registros de cada instituição participante.

O protocolo de pesquisa e o consentimento informado (assinado pelos pais ou responsáveis) foram aprovados pelo Comitê de Bioética de Pesquisa com Seres Humanos do Centro de Pesquisa Universitário da Universidade de Antioquia (n° de aprovação 0841150) e pelo comitê de bioética de cada hospital.

Os dados clínicos e epidemiológicos de cada paciente foram obtidos de prontuários médicos. As informações incluíram características clínicas e demográficas, uso de antimicrobianos, fatores de risco, comorbidades, tipo de infecção, tratamento, tempo de internação e resultado. De acordo com critérios do Centro de Controle e Prevenção de Doenças dos Estados Unidos (CDC), uma infecção é considerada presente no momento da internação (POA) quando a data do evento ocorre no dia da internação em um ambiente hospitalar, dois dias antes da internação e um dia civil após a internação. Uma infecção é considerada associada ao serviço de saúde (HAI) quando a data do evento ocorre a partir do terceiro dia civil de internação em um ambiente hospitalar. Pacientes com infecções do sítio cirúrgico e evento associado ao ventilador foram excluídos.6

A identificação do S. aureus foi feita por métodos laboratoriais padrão com base na morfologia das colônias em ágar de sangue de ovelhas e testes de catalase e coagulase positivos. A susceptibilidade a antibióticos de isolados de S. aureus foi avaliada de acordo com as diretrizes do Instituto de Padrões Clínicos e Laboratoriais (CLSI, 2009) com o sistema VITEK® 2 (BioMérieux, Inc, NC, USA). Os antibióticos testados incluíram clindamicina, eritromicina, gentamicina, linezolida, moxifloxacina, oxacilina, rifampicina, tetraciclina, tigeciclina, trimetoprim‐sulfametoxazol e vancomicina. A cepa de S. aureus ATCC 29213 foi usada para controle de qualidade.

A presença dos genes nuc e femA específicos da espécie, bem como do gene mecA, foi verificada pela reação em cadeia da polimerase (PCR) conforme descrito anteriormente.7,8

Em todos os isolados, a região polimórfica X do gene A da proteína (spa) foi amplificada e sequenciada conforme descrito anteriormente.9 Os tipos spa correspondentes foram atribuídos com o software eGenomics9,10 e os tipos spa do Ridom foram atribuídos posteriormente com o website da tipagem spa (http://www.spaserver.ridom.de/) desenvolvido pela Ridom GmbH e curado pelo SeqNet.org (http://www.SeqNet.org/).11 A MLST foi feita em um subgrupo de dez isolados que representavam os tipos spa mais frequentes, com a metodologia descrita por Enright et al.12 Números de alelos e tipos de sequências (ST) foram atribuídos com o banco de dados mantido em http://saureus.mlst.net/, ao passo que complexos clonais (CC) foram inferidos com a análise eBURST.13 Os complexos clonais de todas as cepas remanescentes foram inferidos pela análise de padrões de repetição do spa10 ou por referência ao website do servidor do spa Ridom.

A PFGE, após a digestão SmaI, foi feita de acordo com um protocolo descrito em outra fonte.14 Os padrões de fragmentos de DNA foram normalizados com a cepa NCTC 8325 do S. aureus. A análise de bloco foi feita com o coeficiente Dice no software BioNumerics (BioNumerics®, versão 6.0, Bélgica). Os dendrogramas foram gerados pelo método da ligação média não ponderada (UPGMA). A similaridade dos pontos de corte de 80% e 95% foi usada para definir tipos e subtipos, respectivamente.14

No que diz respeito a isolados de MRSA, os tipos e subtipos do SCCmec foram determinados com conjuntos de múltiplas reações PCR, conforme descrito anteriormente.15,16 As cepas de MRSA foram incluídas como controles positivos dos tipos e subtipos do SCCmec.

Todos os isolados foram examinados para verificar a existência de genes com a codificação de enterotoxinas estafilocócicas (sea, seb, sec, sed, see), toxina da síndrome do choque tóxico 1 (tst) e toxinas esfoliativas a e b (eta, etb), com os protocolos e as cartilhas descritos por Mehrotra et al.8 Os genes lukS/F‐PV, que codificam a leucocidina de Panton‐Valentine (PVL), e o gene arcA, associado ao elemento móvel catabólico da arginina (ACME), também foram avaliados por PCR.17,18

Foram feitas comparações de características clínicas, epidemiológicas e moleculares entre pacientes infectados por MSSA e MRSA e entre os diferentes grupos de infecções obtidos após aplicação dos critérios do CDC.

As variáveis categóricas foram comparadas com o teste qui‐quadrado ou teste exato de Fisher ou teste t de Student e o teste U de Mann‐Whitney para variáveis contínuas. Valores de p ≤ 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. As análises estatísticas foram feitas com o pacote de software SPSS (IBM SPSS Estatística para Windows, Versão 21.0. NY, EUA).

Foram incluídos 182 pacientes pediátricos com infecções por S. aureus; desses, 65 apresentaram infecções por MSSA e 117 por MRSA; 119 pacientes vieram do hospital A, 51 do hospital B e 12 do hospital C.

Na população estudada selecionada, a proporção de meninos e meninas foi 2:1 e a média foi de dois anos; contudo, 41,2% (n=75) das infecções ocorreram em pacientes até um ano, nos quais foi observada uma alta frequência de infecções por MRSA e MSSA (fig. 1).

Figura 1.

Frequência de infecções por faixa etária.

MSSA, Staphylococcus aureus suscetível à meticilina (n=65); MRSA, Staphylococcus aureus resistente à meticilina (n=117).

A figura mostra a distribuição etária de pacientes infectados por cepas de MSSA e MRSA. Uma maior frequência de infecções é observada em crianças com menos de um ano.

(0,06MB).

De acordo com os critérios do CDC, 62,7% (n=101) das infecções eram observadas no momento da internação (POA) e 37,3% (n=60) corresponderam a Infecções Associadas ao Serviço de Saúde (HAI) (p=0,391). O tipo de infecção mostra diferenças estatisticamente significativas de acordo com o hospital. Nos hospitais A e B houve predominância de infecções POA e no hospital C houve predominância de HAI (p=0,029). Foram identificadas 21 (11,5%) infecções do sítio cirúrgico, as quais não foram incluídas nesta classificação.

As características clínico‐epidemiológicas dos pacientes avaliados no estudo são descritas na tabela 1. Em geral, um histórico prévio de internação foi o antecedente mais frequente entre os pacientes, com 51,65% (n=94); além disso, as internações em centros de atendimento (MRSA 11,1%, n=13, em comparação com MSSA 1,5%, n=1; p=0,020) e o uso prévio de antibióticos (MRSA 55%, n=60, em comparação com MSSA 32,8%, n=20; p=0,005) foram os antecedentes mais frequentes em pacientes com infecções por MRSA.

Em HAI, um histórico prévio de internação na unidade de terapia intensiva (UTI) (MRSA 21,4%, n=9, em comparação com MSSA 0%; p=0,047) e o uso prévio de antibióticos nos últimos seis meses (MRSA 64,1%, n=25, em comparação com MSSA 29,4%, n=5; p=0,017) foram mais frequentes em pacientes com infecções por MRSA.

Por outro lado, o tempo de internação foi maior em pacientes com HAI, com uma diferença significativa em favor de pacientes com infecções por MRSA (MRSA 0‐434 dias, Ma=14, em comparação a MSSA 2‐43 dias, Ma=5,5; p=0,038).

Os locais de infecção mais frequentes foram a pele e o tecido mole, com 41,21% (n=75), e o serviço médico mais comum foi a clínica médica, com 64,84% (n=110).

A frequência de comorbidades na população foi de 74,1% (n=135), mais frequente em pacientes com infecções POA causadas por MSSA (MSSA 81,1%, n=30, em comparação com MRSA 54,7%, n=35; p=0,008).

Precisaram de tratamento cirúrgico 57,6% da população e a cura foi o resultado mais frequente, principalmente em infecções POA causadas por MSSA (MSSA 56,8%, n=21, em comparação com MRSA 34,4%, n=22; p=0,028). Seis dos pacientes incluídos no estudo faleceram; contudo, essa foi a mortalidade bruta e não atribuída à infecção por S. aureus.

Os isolados de MSSA apresentaram seis perfis de resistência, 61,5% (n=40) foram suscetíveis a todos os antibióticos avaliados, 16,9% (n=11) à tetraciclina e 9,2% (n=6) à eritromicina e à clindamicina. Os isolados de MRSA apresentaram oito perfis de resistência, 44,4% (n=52) foram resistentes apenas à oxacilina, seguidos por 28,2% (n=33) com resistência à oxacilina e à tetraciclina. Todos os isolados foram suscetíveis a vancomicina, linezolida e tigeciclina.

Entre todos os isolados, 16 complexos clonais (CC) foram identificados. As cepas de MSSA foram as mais diversificadas, com um número maior de CCs, os mais comuns foram CC8 (29,2%, n=19), CC45 (16,9%, n=11) e CC1 (10,8%, n=7), ao passo que nas cepas de MRSA os CCs mais comuns foram CC8 (70,9%, n=83) e CC5 (22,2%, n=26).

A presença do gene mecA foi confirmada nas 117 cepas de MRSA selecionadas. Dessas, foi possível identificar o tipo de SCCmec em 113 cepas, quatro isolados foram não tipáveis. Dos isolados de MSRA, 70,8% abrigavam o SCCmec IVc (n=80), seguido pelo SCCmec I (20,3%, n=23), SCCmec IVa (5,3%, n=6) e SCCmec V (2,7%, n=3). Um isolado foi identificado com o SCCmec IV, porém não foi possível identificar seu subtipo (0,9%; n=1).

Entre os pacientes com infecções POA, 87,1% (n=54) de isolados de MRSA abrigavam o SCCmec IVc, seguido pelo SCCmec I (8,1%, n=5) e pelo SCCmec IVa (4,8%, n=3). Ao mesmo tempo, isolados de MRSA de pacientes com infecções HAI abrigavam o SCCmec tipo IVc em 56,1% (n=23), seguido pelo SCCmec tipo I (26,8%; n=11), IVa (7,3%; n=3), V (7,3%, n=3) e IV (2,43%, n=1). O SCCmec IVc foi o tipo mais frequente em ambos os tipos de infecção.

Os perfis de resistência dos clones de MRSA mais importantes são apresentados na figura 2.

Figura 2.

Perfis de resistência nos principais clones de MRSA.

A figura mostra o perfil de resistência antimicrobiana dos principais clones de MRSA encontrados no estudo.

Antibióticos avaliados: Oxacilina (Oxa), Tetraciclina (Tet), Clindamicina (Clin), Eritromicina (Eri), Gentamicina (Gen).

Coluna sombreada: isolados pertencentes ao CC5‐SCCmec‐I (n=22); Coluna branca: isolados pertencentes a CC8‐SCCmec‐IVc (n=75).

(0,08MB).

Foram identificados 40 tipos spa diferentes em cepas de MSSA e MRSA. Os tipos mais comuns foram t1610 (17,6%, n=32), t008 (17%, n=31), t149 (11%, n=20) e t024 (9,9%; n=18). Em isolados de MSSA pertencentes ao CC8, foram destacados como os mais frequentes os tipos t1635 e t008, cada um com 9,2% (n=6), e o t922 com 6,2% (n=4) pertencente ao CC1. As cepas mais importantes de MRSA foram as pertencentes ao CC8 e as mais frequentes foram CC8‐SCCmecIVc‐t1610 (27,43%, n=31), CC8‐SCCmecIVc‐t008 (19,47%, n=22), CC5‐SCCmec I‐t149 (16,81%, n=19) e CC8‐SCCmec IVc‐t024 (15,04%, n=17).

Durante o período do estudo, uma variação foi observada nos complexos clonais mais importantes, nos isolados de MSSA e MRSA. O CC5 quase desapareceu completamente, ao passo que o CC8 e o CC45 permaneceram constantes. Além disso, o aumento de outros CCs foi evidente, apesar de nenhum deles ter sido especificamente predominante. Durante os três anos do estudo, o clone pertencente ao CC8‐SCCmec IVc de MRSA foi aumentando, foi o mais prevalente, ao passo que o CC5‐SCCmec I desapareceu no terceiro ano.

Foram analisados 16 isolados de MSSA com PFGE e uma grande diversidade foi encontrada nos resultados (fig. 3A). A análise de MRSA por PFGE foi feita em 26 isolados e quatro grupos relacionados foram identificados. O maior grupo apresentou 15 isolados, que pertenciam ao CC8 e abrigavam o SCCmec IVc; 14 deles foram positivos para pvl e apresentaram tipos spa diferentes (t008, 7/15; t1610, 4/15; t024, 3/15 e t2031, 1/15) (fig. 3B).

Figura 3.

Relação genética em isolados de MSSA e MRSA.

Dendrograma UPGMA mostra a relação genética em uma amostra de isolados de Staphylococcus aureus suscetível à meticilina (MSSA) (A) e Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) (B).

A linha pontilhada indica o ponto de corte ou o coeficiente dos dados de 80%; ela é usada para definir os clones por PFGE. Os blocos acima desse percentual são considerados geneticamente relacionados.

Os isolados identificados com a letra H pertencem ao hospital A, os isolados identificados com a letra P pertencem ao hospital B e os isolados identificados com a letra C pertencem ao hospital C.

(0,62MB).

Oito genes de fatores de virulência foram detectados, em cepas de MSSA e MRSA; apesar disso, uma maior prevalência de genes foi observada nos isolados de MSSA em comparação com os isolados de MRSA. Diferenças estatisticamente significativas foram observadas entre cepas de MSSA e MRSA com relação a genes de pvl (MRSA 76,9%, n=90, em comparação com MSSA 32,3%, n=21; p=0,000), sed (MSSA 33,8%, n=8, em comparação com MRSA 10,3%, n=12; p=0,000) e see (MSSA 12,3%, n=8, em comparação com MRSA 2,6%, n=3; p=0,018).

A presença da pvl mostrou diferenças estatisticamente significativas entre isolados com SCCmec IVc e outros tipos de SCCmec (SCCmec IVc 95%, n=76, em comparação com outro SCCmec 30,3%, n=10; p=0,000). Isso sugere que o gene da pvl é associado com mais frequência com isolados de SCCmec IVc do que de SCCmec I. Genes como sed e tst foram associados ao SCCmec IVa (sed p=0,001; tst p=0,012), ao passo que o gene eta foi associado ao SCCmec V (p=0,027). Nenhum gene etb e arcA (ACME) foi encontrado nos isolados.