A Santa Casa de São Paulo é um hospital geral terciário no centro de São Paulo, com 2.000 nascimentos anuais em média. O Departamento de Obstetrícia é um serviço de referência em partos para programas municipais de gestação de alto risco e aproximadamente 15% dos recém‐nascidos necessitam de cuidados intensivos. A UTIN tem 28 leitos (14 na unidade de cuidados intermediários e 14 na unidade de terapia intensiva), divididos em quatro alas hospitalares fisicamente separadas (fig. 1). Os bebês na sala principal da UTI neonatal são mantidos em incubadoras fechadas ou em aquecedores radiantes abertos e muitos deles necessitam de ventilação mecânica (VM). Para bebês em incubadoras, a maioria dos cuidados de rotina são fornecidos através de portas laterais, mantidas fechadas quando não estão em uso. Aqueles na unidade de cuidados intermediários ficam em berços abertos ou incubadoras fechadas e não necessitam de VM.

Figura 1.

Planta esquemática e simplificada da Unidade de Terapia Intensiva Neonatal e distribuição espacial das coortes, como parte das medidas de controle usadas durante os surtos.

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Em média, mais de 65 profissionais de saúde têm contato físico diário com os bebês na UTIN: seis hospitalistas neonatais, oito estagiários neonatais, quatro residentes pediátricos, quatro estudantes de graduação em medicina, seis profissionais de enfermagem, 34 técnicos(as) de enfermagem e cinco terapeutas respiratórios. Após a higienização das mãos e a substituição das roupas pessoais por aventais (fornecidos pelo hospital), os pais têm permissão para visitar todas as alas e participar do cuidado de seus bebês. Crianças menores de 18 anos não podem entrar na UTIN.

A infecção do trato respiratório superior foi definida quando tosse e rinorreia estavam presentes. O diagnóstico de bronquiolite foi feito com base nos seguintes sintomas: taquipneia, sibilo, tosse, crepitação e/ou abertura das narinas.

Após a identificação de um lactente sintomático com infecção confirmada por VSR, foram coletadas amostras de aspirado de nasofaringe (ANF) de todos os lactentes hospitalizados na UTIN. O controle do ANF foi repetido duas vezes por semana em todos os pacientes. As amostras foram enviadas ao Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo.

O RNA viral foi extraído com o extrator automático NucliSens easyMAG (Biomerieux Inc., Durham, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. A reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa em tempo real (RT‐PCR, do inglês Real‐time reverse transcription polymerase chain reaction) foi feita com o kit AgPath‐ID One‐Step RRT‐PCR e com o 7300 Real‐Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Para identificar o patógeno responsável pelo surto, a RT‐PCR foi feita com o kit RRT‐PCR Panel Kit para vírus não influenza com o objetivo detectar 15 vírus respiratórios – grupo A e grupo B do VSR, metapneumovírus humano, adenovírus, coronavírus humano (HCoV‐HKU, ‐NL63, ‐OC43 e 229E), vírus parainfluenza humano (tipos 1, 2, 3 e 4), bocavírus humano, enterovírus humano e rinovírus humano, que foram fornecidos pelo CDC (Centro de Controle e Prevenção de Doenças, Atlanta GA, EUA),11 e primers e sondas comerciais para influenza A e B (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA).

As amostras positivas de qPCR foram amplificadas por PCR convencional two‐step para sequenciação de DNA: o cDNA foi sintetizado com o kit SuperScript III (Applied Biosystems, Foster City, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. As análises da segunda região hipervariável do gene da proteína G foram feitas com PCR com os primers Gr5_fwd12 e FVAB_rev13 em uma mistura com 5μL de cDNA, 5μL de buffer de PCR [10X], [25mM] de cada: dNTP, [10pmol] de cada primer, 1,0U de Platinum® Taq DNA Polymerase (Invitrogen, Carlsbad, EUA) e água sem nuclease para um volume final de 25μL. A segunda etapa do semi‐nested PCR foi feita para amostras negativas da primeira PCR, com o primerforward GR5_fwd e o primer reverse F1AB_rev14 nas mesmas condições usadas para a PCR convencional. A amplificação foi feita no termociclador do tipo GeneAmp PCR System 9700® (Applied Biosystems, Foster City, EUA) com o seguinte programa: 95°C por 5 minutos, seguido de 35 ciclos, cada um com duração de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 55°C e 45 segundos a 72°C e, finalmente, cinco minutos de extensão a 72°C. Os produtos amplificados foram analisados por eletroforese em gel de agarose e visualizados sob luz ultravioleta após coloração com brometo de etídio. Os produtos amplificados do gene G de ∼1052 e 900 pb, produzidos por PCR convencional e semi‐nested PCR, consecutivamente, foram purificados com ExoSap‐IT (Affymetrix Inc., Santa Clara, EUA) e submetidos a um ciclo de reação de sequenciamento (Sanger) com um kit de coloração fluorescente com todos os primers, GR5, FV e F1AB, no aparelho 3100 DNA Sequencer (Applied Biosystems, Foster City, EUA). Ambas as fitas de cada produto de amplificação foram sequenciadas ao menos duas vezes. A edição das sequências, alinhamentos e análises filogenéticas foi feita com o software MegAlign 5.03v (DNAStar Inc., Madison, EUA). As sequências‐padrão publicadas do subgrupo A foram obtidas do GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) como referência de diferentes linhagens e genótipos.

O caso‐índice envolveu um bebê do sexo masculino prematuro de 30 dias (33 semanas de idade gestacional) com um peso ao nascer de 2.290g, hospitalizado desde o nascimento devido à prematuridade e à displasia broncopulmonar. Estava em desmame da suplementação de oxigênio na unidade de tratamento intermediário quando começou a apresentar tosse, coriza e febre. A insuficiência respiratória desenvolveu‐se rapidamente, exigiu VM. Cinco dias depois, cinco bebês (dos 17 que estavam na UTIN) desenvolveram sintomas respiratórios; portanto, um surto foi declarado (fig. 2). No mesmo dia, amostras de ANF foram coletadas de todos os pacientes na UTIN para a detecção do vírus respiratório por RT‐PCR. Dez bebês estavam infectados com o VSR, dos quais apenas três compartilhavam a ala com o caso índice. A taxa de ataque foi de 58,8% e apenas uma fatalidade ocorreu (Taxa de Letalidade=10%). No entanto, a morte não foi atribuída à infecção pelo VSR, uma vez que o paciente não apresentava sintomas respiratórios e tinha hipoplasia pulmonar congênita, considerada a causa do óbito. Informações adicionais são dadas na tabela 1.

Figura 2.

Linha do tempo dos surtos.

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Medidas de precauções de contato e respiratórias foram imediatamente implantadas. Todos os bebês da UTIN foram separados em três coortes diferentes. Lactentes VSR‐positivos foram colocados na enfermaria 1 sob precauções de contato e respiratórias. Os lactentes negativos para o VSR que tiveram contato prévio com qualquer um dos bebês positivos para o VSR foram colocados nas alas 2 e 3 apenas com precauções de contato. Lactentes negativos para o VSR que nunca tiveram contato com os pacientes positivos para o VSR foram colocados na ala 4.

A equipe de saúde também foi dividida entre as alas e sua programação de rotação interna foi suspensa. Cinquenta integrantes da equipe tiveram amostras de ANF e saliva testadas para vírus respiratórios, com resultado negativo em todas. As visitas à UTIN foram limitadas e sua duração reduzida. As medidas de controle de infecção foram reforçadas para a equipe de saúde e para as famílias dos bebês pelo grupo de controle de infecção e membros da UTIN e incluíram higiene das mãos, limpeza ambiental e aumento da conscientização sobre sintomas respiratórios. No segundo dia do surto, o fármaco palivizumabe foi administrado a todos os bebês na UTIN.

O controle do ANF (teste para os 17 vírus respiratórios, como descrito anteriormente) foi feito duas vezes por semana em todos os bebês na UTIN, de modo que a duração da excreção viral e possíveis coinfecções pudessem ser determinadas. O acompanhamento continuou por quatro semanas após a última amostra positiva ter sido identificada. Os bebês VSR‐positivos foram mantidos isolados até a alta da UTIN, foram testados semanalmente por PCR até que um resultado negativo fosse alcançado. O período mais longo de excreção viral foi de 29 dias.

Durante os 24 dias seguintes, nenhum outro lactente na UTIN desenvolveu sintomas sugestivos de infecção por VSR; portanto, o primeiro surto foi considerado controlado. Trinta e quatro dias após o caso índice, um novo surto foi identificado e as medidas de controle foram restabelecidas (fig. 2). Quatorze lactentes apresentaram VSR, identificado nas secreções respiratórias (tabela 1). O palivizumabe foi administrado apenas a bebês com resultado negativo na PCR para VSR com fatores de risco (oito pacientes). Neste segundo surto, a taxa de ataque foi de 63,6% e duas fatalidades ocorreram (Taxa de Letalidade=14,3%). Ambos os bebês eram prematuros e estavam sob VM quando a infecção pelo VSR foi detectada. Suas mortes foram atribuídas à sepse bacteriana; no entanto, o VSR pode ter contribuído. O tempo de excreção viral mais longo foi de 14 dias.

Entre os 24 bebês positivos para o VSR, 15 (62,5%) nasceram prematuramente com menos de 37 semanas de gestação (tabela 1). A média de idade gestacional foi de 33 semanas (28±40 semanas), a média de idade ao diagnóstico foi de 27,5 dias (variação de um a 80 dias) e a média de peso ao nascer foi de 1961g (variação de 765 a 3.440g). Onze lactentes (45,8%) eram assintomáticos. Entre os bebês sintomáticos, 12,6% apresentavam sintomas respiratórios superiores leves (tosse ou coriza) ou febre, 20,8% apresentavam bronquiolite sem necessidade de VM e 20,8% necessitaram de suporte ventilatório invasivo. Seis lactentes eram elegíveis pelas diretrizes brasileiras para receber palivizumabe.15 Em ambos os surtos, os dados disponíveis não foram suficientes para estabelecer fatores de risco independentes para infecção por VSR.

A análise molecular foi feita para todas as 24 amostras positivas para o VSR (fig. 3). Os vírus isolados durante o primeiro surto foram caracterizados como VSR‐tipo‐A ON‐1, enquanto todas as infecções durante o segundo surto foram causadas pelo VSR‐tipo‐A NA‐2. A análise de aminoácidos evidenciou uma assinatura genética característica nas amostras do segundo surto. Nenhuma coinfecção viral foi detectada em nenhum dos surtos.

Figura 3.

Árvore filogenética do vírus isolado durante os surtos.

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